通过冰芯取样表征药物瓶中的冷冻过程

通过冰芯取样表征药物瓶中的冷冻过程

摘要

原料药 (DS) 的冷冻是一项关键的单元操作，可能会影响产品质量，可能导致蛋白质聚集和不可见颗粒的形成。冷冻浓缩已被确定为影响冷冻期间蛋白质稳定性的关键参数，因此应尽量减少。宏观冷冻浓缩（以下仅称为冷冻浓缩）主要受冷冻速率的影响，而冷冻速率又受独立于产品的工艺参数的影响，例如 DS 容器、其大小和填充水平以及冷冻设备。（大规模）工艺特性研究对于理解和优化冷冻工艺至关重要。然而，评估冷冻浓缩需要对冷冻块进行取样，这通常是通过将冰块切成碎片进行后续分析来完成的。此外，这些研究对大量产品的需求是一个主要限制。在这项研究中，我们报告了一种简单的方法的开发，该方法使用替代溶液在相关规模上对瓶中的冷冻 DS 进行实验表征。新型冰芯取样技术确定中心的轴向冰芯可指示低温浓缩，低温浓缩通过渗透压和组氨酸与聚山梨醇酯 80 (PS80) 的浓度来测量，而渗透压则显示是一种灵敏的读数。最后，我们通过比较不同冷冻方案（-80°C vs -40°C）的低温浓缩来举例说明该方法研究 DS 瓶中低温浓缩的适用性。冷冻过程中的延长应激时间与 2 L DS 瓶轴向中心渗透压量化的更高程度的低温浓缩相关。

关键词 低温浓缩 · 药物瓶 · 冷冻保存 · 大规模冷冻 · 工艺表征

介绍

在生物制药制造中，原料药(DS) 通常以批量方式冷冻，以提高储存稳定性并大程度延长保质期。储存的目标冷冻温度通常为 -20°C、-40°C 或 < -65°C，并且不同公司的冷冻/解冻 (F/T) 设备、规程和目标温度可接受范围通常不同。冷冻 DS 可以长期稳定 DS，降低生物负荷控制（因此为非无菌）DS 中任何潜在微生物生长的风险，并避免 DS 和药物产品 (DP) 的累积稳定性。此外，冷冻 DS 还可以将 DS 与 DP 制造分离，同时提高 DP 生产的灵活性。另一方面，生物 DS 的冷冻和随后的解冻可能会引发物理不稳定性，这可能会影响产品质量，导致蛋白质聚集和颗粒。为了减少 F/T 相关压力和对产品质量的潜在影响，需要了解 F/T 操作，以充分设计和控制这些关键工艺步骤。

冷冻过程尤其会对产品稳定性产生不利影响。已发现各种应力条件可能会在冷冻过程中破坏蛋白质制剂的稳定性，包括冰/液界面处的表面诱导降解以及与冷冻浓缩（也称为冷冻浓缩）相关的不同条件。微观冷冻浓缩是指溶质在冰晶之间微观空间中的必然浓缩，而宏观冷冻浓缩则描述了溶质在宏观层面（厘米级）上的运输。

宏观冷冻浓缩发生在溶液冷冻过程中，此时溶质被排除在不断增长的冰之外并逐渐浓缩，导致在达到玻璃化转变温度 (Tg’) 之前达到最大冷冻浓度，即整个系统凝固。这种宏观冷冻浓缩（下文中将简称为冷冻浓缩）可能通过不同的机制导致蛋白质制剂不稳定，包括辅料结晶可能导致 pH 值变化、离子强度增加以及缓冲剂与蛋白质之间的特定比例变化。值得注意的是，导致蛋白质不稳定的各种冷冻相关降解机制是配方和蛋白质有的，通常无法相互区分。尽量减少冷冻浓缩，从而在冷冻期间和冷冻后实现更均匀（同质）的浓度分布是可取的，这也被认为有利于蛋白质稳定性。

最重要的是，冷冻浓缩受多个产品和配方独立工艺参数的强烈影响，例如冷冻设备、容器类型、几何形状和填充水平。这是因为这些参数会影响冷冻速率和冷冻方向。因此，可以独立于活性药物成分 (API) 进行表征冷冻浓缩的工艺特性研究，例如通过使用替代配方。建议在代表性配置和规模下进行研究，即在 DS 瓶中。冷冻对产品质量的影响，即研究产品相关参数，可以在模拟所需低温浓缩的合适小规模模型中进行，因为大量 DS材料的可用性通常是制造规模工艺特性研究的主要限制。

无论使用何种冷冻工艺和设备，都必须很好地表征该工艺，以便理想地使用不同的冷冻和解冻速率。与 DS 袋不同，由于缺乏市售的活性 F/T 系统，以及在扩大规模过程中与几何相关的工艺挑战，DS 瓶中的控制冷冻尤其具有挑战性。简而言之，增加瓶子尺寸会导致表面与体积比降低，这会严重影响热交换，减慢冷冻过程并可能增加冷冻浓缩。因此需要很好地了解不同规模的冷冻过程。

与 F/T 研究不同，在 F/T 研究中可以在冷冻和解冻后甚至在多次 F/T 循环后收集和分析液体样品，而冷冻过程本身的表征需要对冰块进行取样，以便分析冷冻状态下的冷冻浓度。这些冷冻取样程序通常费力且耗时，需要特定工具将冰块切成随后可进行分析的碎片。先前的研究通常使用带锯切割冰块，而其中一些研究还报告了与这些程序相关的具体挑战 [31–33]，总体而言，此类研究通常仅包括少数实验条件和很少或没有实验重复。

与之前专注于蛋白质稳定性的冷冻研究相比，我们开发了一种简单、快速的方法来研究冷冻状态下的低温浓缩并评估与产品无关的工艺参数，例如冷冻设备、冷冻机类型、冷冻目标温度、容器类型、容器大小等。在本研究中，我们提出了一种新颖的采样技术，通过冰芯钻孔结合替代溶液的使用，可以表征 DS 瓶中的冷冻过程，从而确定进一步研究的关键工艺参数。取样从 DS 瓶的顶部进行，并进一步优化，以通过仅取样相关位置来减少取样工作量。替代溶液中溶质的低温浓缩程度通过渗透压、组氨酸和 PS80 含量来量化。为了举例说明该方法，我们比较了在 -40°C 与 -80°C 静态冷冻条件下 2 L DS 瓶中的低温浓度，以证明区分不同冷冻方案的适用性。

材料和方法

样品制备

制备了代表标准单克隆抗体 (mAb) 配方的替代溶液，该替代溶液包含 20 mM L-组氨酸缓冲液、240 mM 蔗糖、10 mM L-蛋氨酸和 0.04% 聚山梨醇酯 80 (PS80)，pH 值为 5.5（Tg’ -34°C，~ 1.3 cP）。L-组氨酸、L-组氨酸 HCl、L-蛋氨酸和 PS80（J.T. Baker）从 VWR（瑞士迪提康）购买，蔗糖从 Pfanstiehl（瑞士祖格）购买。使用从 VWR（瑞士迪提康）购买的 0.22 µm PVDF 过滤器对制备的替代溶液进行无菌过滤。

将 2 L 替代溶液装入 SaniSure（卢森堡巴沙拉日）提供的 2 L 聚碳酸酯 PharmaTainer™ 瓶中，并在 Thermo Fisher Scientific（美国北卡罗来纳州阿什维尔）的 -80°C 超低温 (ULT) 冰箱 Revco™ (RDE50086FV) 或 Snijders Labs（荷兰蒂尔堡）的 -40°C 低温冰箱 (VF360-45G) 中被动冷冻。

在开始实验运行之前，将单个 DS 瓶放置在空冰箱底架的中央，并将门打开时间为 1 分钟。

Ice Core Sampling 冰芯取样

如图 1 所示，使用冰芯钻孔技术对冷冻取样获得的样品进行冷冻后溶液成分的低温浓缩分析。

连续使用两种不同的设置。第一种设置每瓶收集三个轴向冰芯（图 1a）进行横截面分析。对于边缘（E）和半径向距离（H）冰芯位置的取样，在冷冻前将瓶子的上部切掉并用胶带紧紧封闭。优化的设置（图 1b）仅通过瓶口收集瓶子径向中心的冰芯。顶部的第一个样品总是用直径为 21 毫米的不锈钢手动取芯器手动取出，取样深度约为 20 毫米，以标记后续机器钻孔的位置。

为了在冰芯中钻孔，将瓶子紧紧固定在虎钳中，并使用配备不锈钢芯钻（内径：16 毫米，外径：21 毫米，长度：200 毫米）的电钻机（SFS Group，瑞士 Heerbrugg）进行钻孔，该钻机来自 Bürkle GmbH（德国巴特贝林根）。使用样品弹出器附件将冰芯从空心芯钻中轻轻取出，并放置在干净的工作表面上，预先标记好 25 毫米的部分（图 1c）。将样品分离并转移到试管中进行解冻，并从底部开始编号。由于冷冻后在冷冻块中心存在冰山，因此收集的样品数量从 11 到 13 不等。此外，由于瓶子中心的凹形，H 和 E 轴上的钻孔深度略深。为了消除采样程序（开放式处理）中潜在的外部颗粒污染，样品解冻后用 5.0 µm PVDF MillexSV 注射器过滤器（Merck，瑞士 Buchs）进行过滤，然后储存在 -80°C 下直至分析。

温度曲线

在一个案例研究中，应用两种不同的冷冻方案，即冷冻至 -80°C（RDE50086FV Revco™ ULT 冷冻机）或 -40°C（VF360-45G 低温冷冻机），在冷冻过程中记录了温度曲线。

对于进行冰芯钻探的 DS 瓶，使用 Testo（瑞士门夏尔特多夫）的 Pt-100 温度探头记录 DS 瓶外部的温度（见图 1b）。作为对照，使用相同的温度映射设置记录了单独的对照瓶中的温度曲线，但在液体中放置了额外的 Typ-T 热电偶（来自 TC GmbH）（见图 2），以便将对照瓶的温度曲线与用于冰芯采样的瓶子的温度曲线进行比较。通过比较可以将对照实验中估计的应力时间转移到用于冰芯钻探的 DS 瓶中。对于控制温度测量，将热电偶放置在第一个冻结点 (FPF) 和最后一个冻结点 (LPF) 处，并使用相同的冻结方案进行冻结。对于本研究中使用的配置（被动冻结一个装满 2 L 的 2 L DS 瓶），FPF 和 LPF 分别位于边缘底部和径向中心，液位高度约为 1.5 L，如先前确定的。

分析温度曲线，从两个独立的温度映射实验中评估应力时间的平均值和标准偏差，作为 FPF 处 < 0°C 到 LPF 处 -34°C 之间的时间跨度，即替代溶液的 Tg'。

图 1 冷冻 DS 瓶中冰芯取样技术和温度监测示意图。a 横截面分析：在不同径向位置（瓶子的侧面和顶视图）取样三个冰芯，即在中心 [C]、半径向距离 [H] 和边缘 [E]。b 中心芯分析：通过瓶口取样中心芯。温度探头连接在瓶子外部，用于在冷冻期间记录温度。c 带有冰芯样品弹出器的冰芯钻头和弹出的冰芯，分成 25 毫米长的样品

图 2 DS 瓶内的温度测绘装置示意图，用于记录第一个冻结点 (FPF)、最后一个冻结点 (LPF) 和瓶外的温度

温度数据由 OMEGA Engineering GmbH（德国 Deckenpfronn）的 RDXL6SDUSB 数据记录器记录，并使用 Origin Lab 软件版本 2023（OriginLab Corporation，美国马萨诸塞州北安普敦）进行评估。

分析方法

渗透压

渗透压浓度通过凝固点降低测量，使用 Gonotec 的 Osmomat 3000 仪器，该仪器由 Haslab GmbH（瑞士比尔本肯）订购。样品在校准范围内测量三次，范围在 0 mOsmol/Kg 和 850 mOsmol/Kg 之间。如果需要进行分析，样品用水稀释。

PS80 量化

PS80 通过 Brito & Vaz 描述的 HPLC-荧光胶束测定法进行定量分析。简而言之，根据 Schmidt 等人的方法测量未稀释的样品。使用 Waters Acquity Arc Premier 系统（瑞士巴登）与 Waters 2475 荧光检测器（瑞士巴登）耦合。使用 0.004% 至 0.1% 之间的校准范围，如果需要，用水稀释样品。

组氨酸定量

采用毛细管区带电泳 (CZE) 方法对组氨酸进行定量分析，所用设备为 SCIEX PA800plus 系统（Brea；美国），该系统配备有紫外检测器、214 nm 滤光片（SCIEX）、温控自动采样器和 30 kV 电源。测量采用 Molex（Lisle；美国）的熔融石英毛细管进行，其内径为 30 µm，长度为 20/30 cm。在一个序列中，样品储存在 10°C 的自动采样器中。对于分离缓冲液，使用 150 mM 磷酸盐溶液（pH 1.5）与 5% IPA 混合。在注入样品之前，用 1 M HCl、H2O 和背景电解质冲洗毛细管，或每次在 50 psi 下冲洗三分钟。通过三次标准 CZE 运行和一个空白，使新鲜的毛细管平衡以适应分离缓冲液条件。分离电压设定为 +28 kV。使用的校准范围为 1 至 100 mM 组氨酸，并向每个样品中添加 20 mM 4-氨基苯甲酸作为内标。

数据评估

低温浓缩分析结果以浓度因子表示，其计算方法是将样品浓度除以替代溶液的初始浓度。使用 OriginPro 2023 版（OriginLab Corporation，美国马萨诸塞州北安普顿）对数据进行可视化。

结果与讨论

DS 瓶中的低温浓度分布图

建立了冰芯取样方法，以研究装有 2 L 替代溶液的 2 L DS 瓶中的低温浓缩，该替代溶液代表 mAb 配方。在第一个设置中（图 1a），在从三个轴向冰芯收集的样品中确定了在 -80°C 下冷冻后 2 L 瓶中溶质的分布。渗透压（图 3a）被测量为一个依数参数，代表替代溶液中的组氨酸和蔗糖浓度；组氨酸（图 3b）被量化为缓冲系统和可能的 pH 平衡的变化指标，PS80（图 3c）被量化为生物制剂配方中稳定界面应力的关键赋形剂。对于所有三个测试的配方参数，冷冻本体中的溶质分布阐明了朝向冰丘底部中心和顶部的钟形浓度分布。

之前在不同研究中观察到了溶质的钟形浓度，这些研究采用了类似的条件但不同的采样技术 。例如，将 mAb 制剂在圆形 1 L HDPE 瓶中冷冻至 -70°C（通过渗透压和 mAb 浓度量化）后，其浓度呈钟形。同样，对于不同的冷冻方案，Kolhe 及其同事报告了瓶中冷冻的钟形浓度曲线，而冷冻至 -40°C 和 -20°C 产生的冷冻浓缩程度高于冷冻至 -70°C 的瓶子。Duarte 等人 使用了与本研究中介绍的类似的装置。他们将装满牛血清白蛋白 (BSA) 溶液的 2 L 矩形 DS 瓶冷冻至 -75°C，但使用了带有强制空气对流的干冰室。作者报告称，与本文中提出的替代溶液的结果相比，2 L 瓶内的 BSA 分布情况相当，并且还发现，与前面提到的 Kolhe & Badkar 的研究相反，顶部存在高度浓缩的区域 。Padala 等人在 -30°C 的步入式冷冻柜中冷冻 10 L 玻璃瓶中的 8.5 kg BSA 溶液后，分析了 BSA 的低温浓缩情况，甚至发现顶部的浓度最高。

图 3 a-c 在 -80°C 冰箱中被动冷冻后，2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液的中心核心采样的代表性横截面轮廓图和 d-f 条形图。数字表示 a、d 渗透压、b、e PS80 和 c、f 组氨酸的浓度因子。轮廓图和条形图使用相同的颜色标度进行视觉比较。对于 d-f，数据表示为两个实验的平均值±标准差

在停滞空气条件下（标准 ULT 冷冻机），瓶内被动冷冻预计会以从外到内的径向冷冻几何形状发生，这与冰丘的形成有关。这些冰丘是由于冷冻过程中体积膨胀而形成的，这导致因径向冷冻而滞留在中心的浓缩液体被向上推到顶部。

除了不在本研究范围内的配方相关参数（例如粘度、Tg’）外，已知与工艺相关的参数（例如冷却速率、热流方向、容器几何形状和填充水平）对冷冻后溶质的分布曲线有重大影响。事实上，这些参数影响溶质的对流质量流与被滞留在不断增长的冰中的溶质质量分数之间的相互作用，这最终决定了冷冻块中溶质的分布。例如，冻结锋速度首先影响冰锋的形态，而冰锋的形态决定了被困在冰中的溶质的质量分数；其次，溶质离开冰锋的运动由液相中的扩散和对流决定。因此，快速冻结被描述为减弱冷冻浓缩的程度。

总之，钟形低温浓度分布被认为是 DS 瓶中典型的径向和慢速冷冻几何形状的结果。仅部分被困在径向生长的冰中的溶质被连续输送到中心，而未冻结液体中的密度梯度（由温度梯度引起）促进自然对流，将溶质向下拖拽的速度高于沿径向中心向上输送的速度 。容器几何形状和热流方向决定了形成的冰几何形状，从而决定了尚未凝固的液体的剩余空间，溶质在其中发生对流运动。由于被动冷冻 DS 瓶中溶质的分布分布是径向冷冻几何形状的结果，因此高浓度区域预计沿垂直轴。

因此，我们选择瓶子中的轴心作为分析低温浓度和优化冰芯钻探装置 1 的代表区域（图 1a）。优化设置 2（图 1b）仅从轴心芯收集样本，其中包括最后凝固的代表性中心区域。在优化设置中，冰芯通过瓶口取样，如图 1b 所示，无需切掉瓶子的顶部。

与仅分析中心芯的优化设置（图 3d-f）相比，横截面分析报告的溶质浓度（图 3a-c）产生了类似的结果。横截面分析中的最高浓度位于最底部的中心（位置 1 图 3d-f），而对于优化设置（中心芯分析），最高溶质浓度可重复地发现略高于底部（位置 2 图 3d-f）。在冷冻过程中，横截面分析中瓶子的顶部被切掉并用胶带固定，这意味着瓶子在设置 1 中不是气密的/压力密封的。与最终优化设置中未经操作的瓶子相比，瓶子的操作可能解释了横截面分析中最高溶质浓度位置的轻微变化。与文献数据一致，我们的研究结果证实，瓶子中冷冻块体径向轴的中心核既反映了浓度热点（即顶部和底部附近的最大冷冻浓度），也覆盖了低浓度区域，例如顶部高浓度部分的下方。

已证明与冷冻过程相关的不稳定性是冷冻浓缩产生不均匀冷冻基质的结果。在浓度较低的区域、赋形剂和蛋白质之间比例发生变化的区域以及顶部的冰丘区域 都观察到了降解。与直觉相反，这意味着蛋白质降解通常不会发生在冷冻块中冷冻浓度最高的区域。

因此，中心核心被认为是预测 DS 瓶中冷冻浓缩发生的指示性指标，因为它反映了冷冻浓缩的程度，覆盖了瓶中低浓度和高浓度区域之间的广泛范围。然而，对于使用截然不同的冷冻工艺（例如，可能对瓶中的冷冻几何形状产生影响，如气流冷冻机的情况）的瓶子，建议对瓶子进行扩展分析，以确认中心轴仍然反映瓶子内相关的感兴趣区域。值得注意的是，通过瓶子开口取样的中心核心的优化设置不需要操纵瓶子，并且大大降低了取样程序的复杂性和时间。

不同溶液成分的低温浓缩

为了研究冷冻浓缩，我们分析了渗透压并量化了替代溶液样品的 PS80 和组氨酸浓度，并将结果报告为浓缩因子。对于两种采样装置的三个读数，确定了相似的浓缩因子，如图 3a-c 和 d-f 所示。定量地看，渗透压和组氨酸的趋势产生了可比的浓缩因子，与 PS80 的浓缩因子相比略高。根据替代溶液的成分，渗透压主要反映溶液中的组氨酸和蔗糖浓度。

有趣的是，文献中的几项研究报告称，配方辅料（例如糖和缓冲盐）的浓缩程度通常比蛋白质更高，这主要归因于这些分子的不同扩散系数。在 Bluemel 等人的研究中，在含有 PS80 的组氨酸缓冲液中配制的 mAb 在 2 L 瓶中冷冻至 -40°C。对冷冻块中低温浓缩的分析表明，与溶液中的 mAb 和 PS80 相比，组氨酸的浓缩程度更高。浓缩程度确实与这三种成分的测量扩散系数相关。有趣的是，mAb 和 PS80 的浓缩程度相似，这可以通过 PS80 胶束和 mAb 分子的扩散系数相似来解释。然而，不能排除 PS80 作为一种倾向于与表面（冰/液体表面）相互作用的表面活性分子，其行为可能与其他小分子成分不同，但更相似，就像蛋白质也是两亲分子一样。

其他作者描述说，对流驱动的溶质运动主导了扩散的影响，因此得出结论，化合物扩散系数的差异可以忽略不计。

Weber 和 Hubbuch 通过时间分辨在线拉曼光谱从机制上研究了溶液中不同成分的低温浓缩过程。简而言之，冻结前沿剩余液相中溶质的质量传输是分子对流和扩散运动之间复杂相互作用的基础，这种相互作用受上述过程相关参数的影响，也受决定分子流动性的溶液特性（如其特定的扩散系数和粘度）的影响。

因此，可以假设溶液中的小分子浓缩到更高的程度，这与本研究通过单独观察组氨酸浓度或通过渗透压作为组氨酸和蔗糖的累积参数观察到的结果一致。因此，我们将渗透压视为一种灵敏的读数，以研究 DS 瓶中的冷冻浓缩与冷冻过程的关系。

增加粘度可以通过限制溶液内的自然对流和扩散来抵消冷冻浓缩的影响，这种影响甚至在冷却时会加剧，正如 Bluemel 等人所展示的那样。我们还可以使用我们的装置研究粘度对最终冷冻浓缩的影响。本研究中使用的替代溶液具有相对较低的粘度，代表了一种灵敏的装置，经过优化可研究工艺参数。

总之，尽管 PS80 的冷冻浓缩可能对蛋白质分子具代表性，但为了研究冷冻浓度与冷冻过程参数的关系，渗透压（在我们的配方中主要代表组氨酸和蔗糖）是灵敏的读数，同时与单个成分的含量分析相比，它是一种快速而简单的分析方法。

案例分析

我们采用优化的冷冻取样方法研究了不同冷冻方案（即不同的目标冷冻温度 -40°C 和 -80°C）下 2 L DS 瓶中替代溶液的冷冻浓缩。

我们使用传统的 -40°C 冷冻机故意诱导更长的应力时间，而 -80°C 冷冻由于温差较低而延长了达到 Tg' 以下温度的时间跨度。应力时间是从冰核开始到达到 Tg'（冷冻基质凝固）的时间跨度。在此时间跨度内，液相中的溶质不断浓缩，因此应力时间可视为冷冻过程中冷冻浓缩的指标。

我们根据图 2 所示的设置通过温度映射表征了两种冷冻方案，并确定了在 -80°C 和 -40°C 下冷冻的应力时间分别为 4.9 小时（± 0.2）和 11.2 小时（± 0.2）。图 4 显示了采样瓶（经过冰芯采样）外部记录的代表性温度曲线和相应温度。采样瓶外部记录的温度曲线与温度映射实验的相应曲线相匹配，证明了冷冻程序的可重复性，从而证明了用于估计实际采样瓶中应力时间的温度数据的有效性。

冷冻浓度通过渗透压定量（图 5）。在 -40°C 下冷冻与在 -80°C 下冷冻相比，产生的浓度曲线不同。在 -40°C 下冷冻的瓶子承受的压力时间是其 2 倍多，导致冷冻浓缩程度更高，而且浓缩的底部区域沿着中心核心分布在更宽的区域。因此，我们确认冷冻替代溶液的中心核心采样方法结合渗透压读数是一种灵敏的方法，可以表征和区分冷冻方案并研究 2 L DS 瓶中的冷冻浓度。

图 4 在 a -80°C 冰箱和 b -40°C 冰箱中，2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液被动冷冻的代表性温度曲线。记录了进行冰芯采样的瓶子的温度曲线（紫线），并将其与对照实验记录的温度曲线叠加。在相同条件和冷冻方案下冷冻的对照瓶的温度曲线记录在瓶子外部（红线），以及第一个冷冻点 (FPF)（红色虚线）和最后一个冷冻点 (LPF)（红色虚线）

图 5 在 -40°C 冰箱中被动冷冻后，在 2 L DS 瓶中的 2 L 替代溶液的中心核心中分析的低温浓缩，显示为渗透压的浓度因子

应用和限制

在本研究中，我们报告了一种便捷方法的开发，该方法使用替代溶液在相关规模上对 DS 瓶中的冷冻过程进行实验表征。将所提出的方法与以前报告的采样技术进行比较，几乎所有的冷冻研究都采用冷冻采样，即使用带锯将冷冻块切成小方块。这些程序通常需要首先将容器与冷冻块分离，然后沿三维轴逐片切割冷冻块或从预切切片中取出核心样本，最终获得大小相同的样品块。在实践中，这个过程很费力，因此很耗时，并且需要特定的设备和设施。此外，以前报告的程序仍然存在一些挑战，例如需要预冷锯片或在切割前将样品存放在干冰上。此外，根据容器的表面材料，报告称冷冻块与容器的紧密粘附，这需要例如加热接触面以将冰从容器壁上分离。

然而，所有冷冻采样技术，包括我们的岩心钻探技术，都需要开放式处理，存在样品受到外部污染（例如颗粒污染）的风险。根据所采用的溶液（替代物或蛋白质溶液）和分析方法，应采用适当的样品制备方法。然而，像本研究中报告的技术一样，采用更少的处理步骤并且对 DS 容器本身无损的采样技术最终将减少来自环境和过程的潜在颗粒污染。

尽管通常没有明确提及，但采样程序本身被认为对结果有重大影响，特别是对冷冻浓缩的程度，通常报告为与初始浓度相比的浓度因子。通过冷冻采样确定冷冻浓度在很大程度上取决于采样冰块的大小，正如之前提到的。值得注意的是，冷冻采样方法总是描述宏观的，而不是微观的冷冻浓缩，因此从冷冻块中收集的样品的大小/体积肯定决定了样品的稀释程度。例如，在高浓度区域收集的较小尺寸的样品会产生更高的最大浓度，这在概念上可以描述为方法的“分辨率"。在数据解释和实验设计中，应考虑这种不可避免的样本量依赖性限制。这意味着，使用不同采样设置和配置的不同研究的结果不能直接相互比较，并且采样技术从冷冻批量中收集相同大小的样品的能力至关重要，即使样本大小的某些变化是不可避免的，例如由于冰结构和成分的变化。本研究开发的技术通过仔细选择钻井设备的尺寸并随后分离冷冻样品，有助于生成小样本。

由于冷冻过程主要由与产品无关的工艺参数决定，例如如上所述的容器几何形状、尺寸和填充量，因此使用替代品（代替高价值的蛋白质溶液）进行工艺表征研究能够表征冷冻过程，并允许在相关的代表性配置和规模（即在 DS 瓶中）下进行实验表征。使用替代溶液可以进行大量独立于产品的实验和各种工艺参数的测试，从而能够筛选和识别关键工艺参数。根据冷冻研究的目的，可以优化替代溶液的性质，使其与特定产品的性质相匹配，或与典型的 DS 溶液的性质相匹配。在我们的研究中，我们选择了一种具有典型配方成分的替代溶液，该替代溶液具有与冷冻浓缩相关的但最坏情况的性质（低粘度和低 Tg'），以生成一个灵敏的设置来量化冷冻浓缩。对于以工艺参数为重点的工艺表征，渗透压是一种简单而有代表性的读数，用于指示替代溶液的冷冻浓缩的发生。

由于 DS 材料的可用性通常是制造规模工艺表征研究的主要限制，因此可以在合适的小规模模型中研究冷冻对产品质量的影响，这些模型模拟预期浓度，例如在使用替代溶液进行相关规模的补充实验中确定的浓度。因此，了解冷冻过程和过程参数的相关性也使得选择有意义且相关的条件进行小规模产品质量测试成为可能。

结论

冷冻和解冻是生物分子制造过程中的关键单元操作，必须对其进行充分表征以尽量减少其对产品质量的影响。

特别是冷冻过程可能会在整个冷冻 DS 中产生相当大的不均匀性，这与许多不利条件有关，例如赋形剂和蛋白质浓度的变化、与自身相互作用倾向的潜在变化相关的离子强度变化或 pH 值的变化，这可能会影响聚集体形成和颗粒物等关键质量属性。

为了研究 DS 瓶中的低温浓缩，我们报告了一种简单的采样方法，通过冰芯钻孔使用渗透压作为一种快速灵敏的读数，而不是以前耗时且复杂的冷冻采样技术。我们的方法特别适合表征与产品无关的工艺参数，例如比较冷冻设备或冷冻方案，如案例研究中所示。使用替代溶液可以在足够高的分辨率下筛选制造规模的多个工艺参数，以便识别关键工艺参数，而无需大量蛋白质溶液。

缩写 API：活性药物成分；BSA：牛血清白蛋白；C：中心；CZE：毛细管区带电泳；DS：药物物质；DP：药物产品；E：边缘；FPF：第一个冷冻点；F/T：冷冻/解冻；H：半径向距离；LPF：最后一个冷冻点；mAb：单克隆抗体；PS80：聚山梨醇酯 80；Tg：玻璃化转变温度；ULT：超低温